自然界中的植物都会面临各种病害的侵染。病害防治更是农业生产中的重中之重。科学家们一直致力于用各种技术研究植物病害的发病机制和防治方法。在近年的最新研究中，新兴的组学研究技术逐渐成为病害研究的热点。在各种组学技术中，从直观、无损、快速、简便以及农业应用推广上考虑，植物表型成像分析技术无疑是最优的选择之一。

 

PlantScreen植物表型成像分析系统及表型成像图

 

传统表型概念里以形态学指标为主。而现代植物表型成像分析技术已经不局限于形态学，其主要应用的成像技术如下，它们在植物病害研究分别反映植物的不同表型变化与生理过程：

 

技术类别	表型与生理过程	病害研究用途	常用参数指标
叶绿素荧光成像技术	植物光合能力、光合电子传递链、光系统热耗散等光合生理过程	评估病害对光合系统损伤程度与机制；由于光系统对胁迫的敏感性，是病害早期预警的最灵敏且最常用技术之一	最大光化学效率Fv/Fm、实际光化学效率QY、非光化学淬灭系数NPQ、荧光衰减率“活力指数”Rfd等
UV-MCF紫外激发多光谱荧光成像技术	植物在病斑及周边区域合成大量黄酮、多酚类次生代谢物，以防御病害的扩散	通过测量次生代谢物荧光，评估病害的发生程度与植物防御机制的激活	次生代谢物荧光F440、F520；叶绿素荧光F690、F740
形态成像分析技术	株高、株宽、叶面积、生物量、生长动态、色彩变化等形态的影响	评估不同条件下对植物形态的影响乃至增产效应	株高、叶面积及病斑面积、数字生物量等
多/高光谱（反射光谱）成像分析技术	通过反射光谱的变化定量反映植物活力、色素组成、光合作用、生化组成、氮素营养、水分含量等表型生理，对病害的影响进行间接测量。	病害对从健康程度、色素组成、营养状况等方面的影响，同时也配合叶绿素荧光成像技术对病害抗性进行进一步验证。	归一化植被指数NDVI、光化学反射指数PRI、花青素反射指数ARI、胡萝卜素反射指数CRI等
红外热成像技术	获得植物表面温度分布图及温度数据	通过叶片温度反映由于病害导致的叶片气孔导度变化、代谢紊乱等	平均温度、温度范围、水胁迫指数I

 

植物病害的病原体有病毒、细菌、真菌。而植物种类又有模式植物、谷物、蔬菜、水果等。植物表型成像分析技术能够应对这些不同的研究需求吗？我们从具体的文献案例里查找答案，本期主要介绍关于抗病毒基因、蔬菜水果的叶片细菌病害相关研究案例：

 

一、利用模式植物研究抗病毒基因

法国国家农业科学研究院（INRA）的Jean-Luc Gallois研究团队一直致力于马铃薯y病毒组的抗病基因研究。这一病毒组中包括芜菁花叶病毒(TuMV)、西瓜花叶病毒(WMV)、三叶草黄脉病毒(ClYVV)等重要的农作物病毒。这方面研究的难点在于如何直观、定量地测量病毒在植物样品上的分布与积累。FluorCam多光谱荧光成像技术的出现解决了这一难题。FluorCam多光谱荧光成像技术仅能进行了叶绿素荧光成像测量，也提供了关键的GFP标记病毒活体成像图。GFP成像图直观地表现病毒量的差异，反映了不同基因功能对拟南芥病毒抗性的影响。同时，叶绿素荧光成像则反映病毒对光合系统的损伤，可以同步提供病害光合表型信息。

法国国家农业科学研究院利用FluorCam封闭式荧光成像系统，从2015年起发表了一系列相关文章，研究方向包括病毒的TOR信号调控、跨物种合成eIF4E1等位基因获得病毒抗性、利用CRISPR-Cas9 base editing基因编辑技术模仿eIF4E自然多态性与病毒抗性的关系、拟南芥敲除eIF4E1获得ClYVV抗性但又与TuMV的敏感性相关等。

 

 

虽然GFP活体成像技术一般不归于植物表型成像技术中，但在病害研究中会经常利用带GFP标记的病原体来定量分析感染面积与病毒积累量。FluorCam多光谱荧光成像技术的GFP活体成像功能也广泛应用与其他病原体的指示测量。

 

左图：GFP标记的丁香假单胞杆菌感染软枣猕猴桃枝条（EcoTech生态实验室提供）；右图：碱性金属蛋白酶对GFP标记的TMV处理效果（Qin，2019）

 

参考文献：

1.        Zafirov D, et al. 2021. When a knockout is an Achilles' heel: Resistance to one potyvirus species triggers hypersusceptibility to another one in Arabidopsis thaliana. Mol Plant Pathol. 22: 334–347

2.        Bastet A, et al. 2019. Mimicking natural polymorphism in eIF4E by CRISPR‐Cas9 base editing is associated with resistance to potyviruses. Plant Biotechnology Journal 17: 1736–1750

3.        Bastet A, et al. 2018. Trans-species synthetic gene design allows resistance pyramiding and broad-spectrum engineering of virus resistance in plants. Plant Biotechnology Journal: 1–13

4.        Qin Y, et al. 2019. Purification and Characterization of a Secretory Alkaline Metalloprotease with Highly Potent Antiviral Activity from Serratia marcescens Strain S3. Journal of Agricultural and Food Chemistry 67(11): 3168-3178

 

二、病害快速无损检测与抗性品种鉴定

对植物病害进行快速检测与早期预警，无损快速的植物表型成像技术无疑是不二之选。但植物表型组的相关参数至少有几十项，哪一项才是最灵敏和最准确的呢？很多科学家都进行了相关的探索。

德国莱布尼茨蔬菜和观赏植物研究所IGZ将刚发芽的生菜幼苗感染了立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），之后使用多种表型成像分析技术测试了各种不同参数，试图确定哪些技术的哪个参数能够更灵敏地将感染病害的植株和未感染的植株区分开。

研究中进行成像分析的参数与所属技术如下：

l  叶绿素荧光成像：Fo、Fp、Ft、Fv、最大光化学效率Fv/Fm、荧光衰减比率Rfd、光合有效叶面积日相对生长速率A_abs和A_rel

l  UV-MCF多光谱荧光成像：F440、F520、F690、F740及各个参数之间的比值

l  红外热成像：作物水胁迫指数I1、I2、I3、平均温度、中值温度、温度范围

l  反射光谱成像：R_NIR、R_RED、归一化植被指数NDVI

成像技术的另一个优势就是可以同时测量几十株乃至上百株幼苗样品，通过配套软件就能够简便地去除图像中的背景，自动计算相应的参数。

更为方便的是，一台加装红外热成像模块的FluorCam多光谱荧光成像系统就可以完成所有上述参数的测量与成像。

 

左图：FluorCam及最新型FluorCam-Pro多光谱荧光成像系统；中图：反射光谱归一化植被指数NDVI成像图的背景分割；右图：基于RGB真彩成像对热成像图进行背景分割

 

测试结果发现，感染病害的植株和未感染的植株之间，最大光化学效率Fv/Fm、荧光衰减比率Rfd、归一化植被指数NDVI、作物水胁迫指数I1、光合有效叶面积日相对生长速率A_rel、多光谱荧光F440、F520等参数都表现出显著差异。通过进一步数据统计分析最终发现最大光化学效率Fv/Fm、荧光衰减比率Rfd在本次实验中的识别效果最好，误差≤0.052。Fv/Fm＞0.73的生菜幼苗即可认为是健康的。Fv/Fm甚至能够在病害症状发生前即可检测到病菌感染。研究者希望通过进一步工作，将这一发现应用于园艺和农业生产实践，比如优良抗病蔬菜品种的选育、病害的早期发现与防治等。

 

荧光衰减比率Rfd和最大光化学效率Fv/Fm的逻辑回归函数，概率1代表健康植株，概率0代表染病植株

 

浙江大学同时使用FluorCam荧光成像系统对柑橘黄龙病进行了检测分析。研究者通过对健康叶片、感染黄龙病叶片和养分缺乏叶片进行叶绿素荧光成像分析，确定了黄龙病独一无二的荧光标志，即“光合指纹”，结合叶绿素荧光参数与成像图，对叶片黄龙病取得了最佳识别分类效果，准确率达到97%。

 

左：不同特征选择法获得的叶绿素荧光成像图；右：实际测量中的FluorCam叶绿素荧光成像系统与柑橘叶片样品

 

参考文献：

1.        Sandmann M, et al. 2018. The use of features from fluorescence, thermography and NDVI imaging to detect biotic stress in lettuce. Plant Disease 102: 1101-1107

2.        Weng H, et al. 2020. Characterization and detection of leaf photosynthetic response to citrus Huanglongbing from cool to hot seasons in two orchards. Transactions of the ASABE 63(2): 501-512

 

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